Erdheim Chester La malattia (ECD) è causata da mutazioni nel DNA delle cellule del sangue. Le cellule del sangue si formano nel midollo osseo da cellule staminali che possono vivere per molti anni producendo molte generazioni di nuove cellule staminali. Le domande frequenti che i pazienti si pongono su ECD sono: da dove viene? da quanto tempo ce l’ho? non si poteva fare qualcosa prima? perché la mia malattia colpisce un sito particolare? La nostra ricerca mira a far luce su queste importanti domande. La tecnica che utilizzeremo si chiama “mappatura filogenetica”. Questo approccio ci permette di andare indietro nel tempo e di “datare” l’origine delle mutazioni che causano ECD, fino a pochi anni di vita del paziente. Il metodo consiste nel far crescere in laboratorio molti cloni di singole cellule staminali e nel sequenziare l’intero genoma di ciascun clone. Ogni clone si differenzia dall’altro per alcune mutazioni nel suo DNA. Alcune di queste mutazioni sono sorte molto tempo fa nei progenitori della cellula staminale quando il paziente era più giovane. Sequenziando un centinaio di cloni è possibile ricostruire la storia di vita delle cellule staminali all’interno di una persona e creare così una cronologia delle mutazioni che compaiono nel corso degli anni. Tra queste mutazioni ci sarà la mutazione che ha causato ECD nel paziente. Se conosciamo la cronologia di tutte le mutazioni, possiamo “datare” la mutazione ECD. Possiamo quindi stimare per quanto tempo la mutazione ECD è rimasta latente nell’organismo, quanto rapidamente è cresciuta fino a raggiungere dimensioni tali da causare malattie e se è stata assistita da altre mutazioni nel corso del percorso. Si tratta di questioni fondamentali. In altre malattie correlate, chiamate neoplasie mieloproliferative, le mutazioni insorgono nell’infanzia e si evolvono in diversi tipi di malattia a seconda di altri eventi nella vita del paziente, nel corso di decenni. Applicando questa analisi a ECD, dovremmo essere in grado di rispondere alle domande sulla sua origine. I potenziali vantaggi includono anche la possibilità di individuare ECD in una fase precoce, prima che si evolva fino a causare la malattia; di determinare perché esiste uno spettro di organi colpiti in pazienti diversi e perché alcuni pazienti presentano una malattia a rischio più elevato che progredisce più rapidamente. Infine, svelare la “storia di vita personale” di ECD potrebbe aiutarci in futuro con una terapia personalizzata per ottenere risultati migliori.
Importo: 200.000 USD in collaborazione con la Leukemia & Lymphoma Society
Rapporto intermedio
Sintesi della ricerca
Erdheim Chester La malattia (ECD) è causata da mutazioni nel DNA delle cellule del sangue. Le cellule del sangue si formano nel midollo osseo da cellule staminali che possono vivere per molti anni producendo molte generazioni di nuove cellule staminali. Le domande frequenti che i pazienti si pongono su ECD sono: da dove viene? da quanto tempo ce l’ho? non si poteva fare qualcosa prima? perché la mia malattia colpisce un sito particolare? La nostra ricerca mira a far luce su queste importanti domande. La tecnica che utilizzeremo si chiama “mappatura filogenetica”. Questo approccio ci permette di andare indietro nel tempo e di “datare” l’origine delle mutazioni che causano ECD, fino a pochi anni di vita del paziente. Il metodo consiste nel far crescere in laboratorio molti cloni di singole cellule staminali e nel sequenziare l’intero genoma di ciascun clone. Ogni clone si differenzia dall’altro per alcune mutazioni nel suo DNA. Alcune di queste mutazioni sono sorte molto tempo fa nei progenitori della cellula staminale, quando il paziente era più giovane. Sequenziando un centinaio di cloni è possibile ricostruire la storia di vita delle cellule staminali all’interno di una persona e creare così una linea temporale delle mutazioni che compaiono nel corso degli anni. Questo è come disegnare un albero genealogico di come tutte le cellule sono imparentate tra loro ed è noto come “filogenesi”. Tra queste mutazioni ci sarà la mutazione che ha causato ECD nel paziente. Se conosciamo la cronologia di tutte le mutazioni, possiamo “datare” la mutazione ECD. Possiamo quindi stimare per quanto tempo la mutazione ECD è rimasta latente nell’organismo, quanto velocemente è cresciuta fino a raggiungere dimensioni tali da causare malattie e se è stata assistita da altre mutazioni nel corso del percorso. Si tratta di questioni fondamentali. In altre malattie correlate, chiamate neoplasie mieloproliferative, le mutazioni insorgono nell’infanzia e si evolvono in diversi tipi di malattia a seconda di altri eventi nella vita del paziente, nel corso di decenni. Applicando questa analisi a ECD, dovremmo essere in grado di rispondere alle domande sulla sua origine. I potenziali vantaggi includono anche la possibilità di individuare ECD in una fase precoce, prima che si evolva in una malattia; di determinare perché esiste uno spettro di organi colpiti in pazienti diversi e perché alcuni pazienti presentano una malattia a rischio più elevato che progredisce più rapidamente. Infine, svelare la “storia di vita personale” di ECD potrebbe aiutarci in futuro a personalizzare la terapia per ottenere risultati migliori.
Progressi
Abbiamo espanso con successo i cloni di 5 pazienti, 3 con ECD, 1 con cross-over ECD/LCH e 1 con LCH. In 2 di questi casi, abbiamo catturato cloni mutati BRAFV600E ma, inaspettatamente, in 3 pazienti non c’erano cloni mutati BRAFV600E, anche se la mutazione era rilevabile nel loro sangue. Stiamo ulteriormente esplorando la posizione della mutazione in questi pazienti per confermare che si trova nella popolazione delle cellule staminali.
Nei pazienti in cui abbiamo ottenuto cloni espansi contenenti cloni mutati BRAFV600E, abbiamo sequenziato quasi 300 genomi interi e ricostruito gli alberi genealogici (filogenesi). Abbiamo osservato, in entrambi i pazienti, che almeno tre mutazioni erano sorte quasi contemporaneamente nei geni KRAS, NRAS e BRAF. Sorprendentemente, sembravano essere eventi indipendenti, poiché ogni mutazione si trovava su un ramo separato della filogenesi (vedi figura). Non ce lo aspettavamo, perché la maggior parte dei tumori si evolve, con una mutazione che porta a un’altra mutazione e così via con tutte le mutazioni che contribuiscono a un unico ramo. Quello che abbiamo osservato in ECD è un processo parallelo con più rami che si evolvono tutti insieme. Il prossimo passo è scoprire se questi rami paralleli sono presenti tutti insieme nelle lesioni di ECD nei tessuti. Se ciò venisse confermato, si potrebbe ipotizzare che in qualche modo
operino insieme. Questo schema è diverso da quello osservato in qualsiasi altro tumore e potrebbe essere un evento molto raro. Potenzialmente, questo potrebbe spiegare perché ECD è così poco comune.
In che misura abbiamo risposto alle domande della ricerca?
Le domande a cui ci siamo prefissati di rispondere sono elencate di seguito e i nostri progressi fino ad oggi sono riportati in corsivo
- A che età della vita si verificano le mutazioni che portano a ECD?
Quanto velocemente i cloni si espandono fino a causare malattie?
Qual è la latenza tra la mutazione e la comparsa della malattia?
In entrambi i pazienti, che avevano più di 50 anni, sembra che le mutazioni siano insorte almeno due o tre decenni prima. Queste caratteristiche sono simili a quelle delle neoplasie mieloproliferative. In teoria, dovrebbe essere possibile tracciare e identificare il rischio di ECD già nelle prime fasi della vita. - In che modo BRAFV600E interagisce con l’ematopoiesi clonale mutata TET2?
Qual è la sequenza delle mutazioni?
La mutazione di TET2 promuove ECD attraverso un effetto cellulare autonomo?
La mutazione TET2 aumenta il tasso di fitness/crescita dei cloni ECD?
TET2 è ancora in fase di analisi in questi due pazienti. Gli altri geni, KRAS e NRAS, sono noti per essere associati a ECD. Sorprendentemente abbiamo scoperto che ciascun gene operava in modo indipendente da BRAF nella filogenesi – l’opposto di quanto ci aspettavamo. Dobbiamo confermare se questo è vero nel tessuto lesionale. - Vengono trovate nuove mutazioni driver in pazienti privi di mutazioni note dell’emopoiesi clonale?
Non abbiamo ancora trovato nuove mutazioni driver, ma stiamo ancora analizzando i dati. Abbiamo riscontrato un modello molto insolito di mutazioni driver, come descritto in precedenza.
Piano per il secondo anno
Il nostro obiettivo è quello di risolvere le seguenti questioni nei prossimi 12 mesi
- Dobbiamo verificare in quali cellule si trova la mutazione BRAF nei pazienti i cui cloni espansi non contenevano BRAF mutato. O la mutazione non si trova dove ci aspettiamo, oppure potrebbe esserci un problema con l’espansione in vitro di cellule che contengono BRAF mutato (punto 2).
- Stiamo anche esplorando un nuovo modo di generare il DNA per il sequenziamento che non prevede la crescita di cloni. Prevediamo che questo ci aiuterà a mappare le mutazioni nelle cellule BRAF-mutate che non si espandono in cloni in vitro.
- Dobbiamo confermare che l’insolito modello parallelo che abbiamo osservato finora nelle filogenesi è presente anche nelle lesioni dei pazienti.
Spiegazione di come il modello dell’istiocitosi non sia mai stato osservato in altri tipi di cancro.